Virus SARS-CoV-2 (Covid-19) và cơ chế diệt khuẩn của nano bạc (Ag+)

SARS-CoV-2 là nguyên nhân gây ra vài triệu ca tử vong cho đến nay trên toàn cầu. Việc lây truyền qua các bề mặt cũng như lây truyền trong không khí là nguyên nhân lớn dẫn đến sự lây lan của virus. Trong bài viết này, Nano-Care Nano Silver sẽ cập nhật các kiến thức để kháng virus mà không phải ai cũng biết.

Qua thí nghiệm các lớp phủ hạt của ba vật liệu kháng khuẩn (Ag, CuO và ZnO) về hoạt tính của chúng chống lại khả năng tồn tại của SARS-CoV-2 đã chứng minh: Các lớp phủ nano (Ag) có hoạt tính kháng virus mạnh nhất trong các vật liệu được nghiên cứu cùng. Trong khi oxit đồng (CuO) thể hiện hoạt tính vừa phải và oxit kẽm (ZnO) dường như không làm giảm đáng kể khả năng lây nhiễm virus.

1. Tổng quan về virus SARS-CoV-2

Hội chứng hô hấp cấp tính nghiêm trọng coronavirus 2 (SARS-CoV-2) là một loại virus RNA có vỏ bọc gây ra bệnh đường hô hấp 2019 (COVID-19) và đã dẫn đến hơn 3 triệu ca tử vong cho đến nay. Tổ chức Y tế Thế giới (WHO, Geneva, Thụy Sĩ) kết luận rằng các đường truyền nhỏ giọt, tiếp xúc, fomite (bề mặt bị ô nhiễm) và trong không khí (sol khí) được coi là các con đường lây nhiễm tiềm ẩn và tiếp tục khuyến nghị các biện pháp phòng ngừa tiếp xúc với giọt và tiếp xúc cho những người chăm sóc Bệnh nhân COVID-19. 

Khi những người bị nhiễm coronavirus mới SARS-CoV-2 ho hoặc hắt hơi, họ có thể phát ra các giọt nhỏ chứa virus, dẫn đến nhiễm bẩn các bề mặt xung quanh của họ và có nguy cơ lây truyền sang người khác qua giọt bắn nước bọt. SARS-CoV-2 vẫn ổn định trên bề mặt trong nhiều giờ sau khi dính vào, đây cũng là một con đường tiềm năng để lây nhiễm cho người khỏe mạnh. 

Một nghiên cứu vào tháng 3 năm 2020 cho thấy có sự khác biệt lớn về tính ổn định của virus này trên các bề mặt khác nhau (nhựa, thép không gỉ, bìa cứng, đồng) và điều này đã thúc đẩy các nhà nghiên cứu tìm hiểu xem liệu có thể điều chỉnh các đặc tính hóa lý của bề mặt để làm giảm tính ổn định của SARS-CoV-2 hay không. Hơn nữa, trong trường hợp lây truyền qua đường khí dung, hiệu quả lọc không khí và khử trùng của các bộ lọc/tuần hoàn không khí đóng một vai trò quan trọng trong việc giảm thiểu sự lây truyền virus, đặc biệt là ở những khu vực không có nguồn cung cấp không khí bên ngoài (ví dụ: các phương tiện giao thông công cộng) hoặc trong các phòng khám bệnh viện.

Trong những năm gần đây, người ta ngày càng quan tâm đến việc sử dụng các vật liệu bề mặt tự khử nhiễm như các biện pháp an toàn bổ sung nhằm ngăn ngừa sự lây truyền bệnh tật. Ví dụ như sử dụng các lớp phủ bề mặt với các hạt nano Ag, CuO và ZnO. 

Nanosilver (Ag) có lẽ là vật liệu nano kháng khuẩn được nghiên cứu nhiều nhất và cơ chế kháng khuẩn của nó phần lớn là do giải phóng các ion Ag + khi tiếp xúc với hệ thống nước. Nanosilver tiêu diệt vi khuẩn bằng cách nhắm mục tiêu vào vỏ tế bào vi khuẩn và tạo ra các loại oxy phản ứng. Do hoạt tính kháng khuẩn cao của nó, nanosilver đã được khám phá như một lớp phủ kháng sinh, trong khi hoạt tính kháng khuẩn của nó cũng đã được thể hiện chống lại nấm và virus bao gồm SARS-CoV-2. 

Tương tự, cả hai hạt nano CuO và ZnO đã được nghiên cứu như vật liệu kháng khuẩn, nhưng ở mức độ thấp hơn so với nano. Mục đích của nghiên cứu này là sửa đổi các bề mặt bằng các lớp phủ hạt nano kháng virus như vậy và so sánh khả năng vô hiệu hóa coronavirus mới của chúng khi hạ cánh trên các bề mặt này. Các lớp phủ có cấu trúc nano này được phát triển bằng cách sử dụng quy trình sản xuất nano có thể mở rộng và có thể tái tạo. Cụ thể là lắng đọng các hạt nano trong quá trình nhiệt phân, để hỗ trợ tích hợp dễ dàng trong sản xuất các thành phần lọc không khí nhanh trong công nghiệp. Các lớp phủ Ag, CuO và ZnO trên cả nền rắn phẳng (thủy tinh) cũng như phương tiện lọc xốp (bộ lọc sợi thủy tinh và bộ lọc FFP3) được sản xuất với mục đích nghiên cứu hoạt tính kháng virus của chúng chống lại SARS-CoV-2 trong các điều kiện ủ giống hệt nhau.

2. Vật liệu và phương pháp

2.1. Thiết lập hoạt động diệt vi rút của các hạt nano

Các lam kính 22 × 22 mm được phủ bằng lớp phủ nano (Ag / SiO 2 , CuO và ZnO) hoặc không phủ được đặt vào một đĩa 6 cm và một giọt 50 μL SARS-CoV-2 được đặt ở giữa đĩa. Giọt nước này ngay lập tức được phủ bằng một tấm kính không tráng để lây lan virus ra toàn bộ khu vực. Sau khi ủ trong các khoảng thời gian khác nhau (5, 30, 120 phút) ở nhiệt độ phòng, 1950 μL dung dịch muối đệm phosphat 1X (PBS) đã được thêm vào tấm bìa. Nắp trượt được nâng lên và lật lên, và hai mặt tiếp xúc với virus được rửa nhẹ nhàng bằng pipet 10 lần. Sau đó, toàn bộ nước rửa được thu thập và bảo quản ở -80 ° C để xác định hiệu giá.

2.2. Xét nghiệm mảng bám

Tế bào Vero-E6 hợp lưu trong các đĩa 24 tiếng được rửa bằng PBS, và pha loãng hai lần virus SARS-CoV-2 được thêm vào trong môi trường thiết yếu tối thiểu 200 μL (Sigma, Munich, Germany) bổ sung 0,2% albumin huyết thanh, 2 mM L-glutamine và 20 mM HEPES với lắc định kỳ trong 1 giờ ở nhiệt độ 37 ° C. Các dung dịch virus sau đó được loại bỏ, và các tế bào được rửa sạch bằng PBS trước khi thêm 1 mL lớp phủ đã được làm ấm trước (2% methylcellulose: môi trường nhân giống chứa 2% FBS = 2: 3). Ở 48-72 giờ sau khi lây nhiễm, các tế bào được cố định bằng 4% formaldehyde và nhuộm bằng dung dịch tím pha lê sau khi loại bỏ lớp phủ, và các mảng được định lượng thủ công. Việc xác định tất cả các hiệu giá vi rút được thực hiện trong ba lần.

3. Kết quả và thảo luận

Quá trình sản xuất và lắng đọng tại chỗ các hạt nano chống virus trên các chất nền đã chọn được thể hiện dưới dạng giản đồ trong Hình 1. Chúng tôi sử dụng một lò phản ứng aerosol trong đó các hạt nano sản phẩm được tạo ra bằng cách nhiệt phân phun ngọn lửa các dung dịch tiền chất lỏng có chứa kim loại thích hợp. Trong quá trình này, sol khí nóng như đã chuẩn bị được lắng đọng bằng phương pháp nhiệt di tiếp tục xuống phía hạ lưu trên các chất nền rắn đã chọn được gắn với giá đỡ làm mát bằng nước, hoặc bằng cách lọc trên các vật liệu lọc xốp đã chọn với sự hỗ trợ của bơm chân không. Độ dày và độ xốp của màng hạt nano được kiểm soát bởi thời gian lắng đọng cũng như bước ủ lửa tại chỗ tùy chọn, trong đó màng được ổn định cơ học bằng ngọn lửa không có hạt.

Hình 1. Sơ đồ quá trình lắng đọng sol khí ngọn lửa của lớp phủ hạt nano kháng virus trên nền phẳng rắn cũng như trên vật liệu lọc xốp. Các lớp phủ hạt nano như đã chuẩn bị sau đó được ủ với SARS-CoV-2, và hoạt tính kháng vi rút của chúng được kiểm tra bằng xét nghiệm mảng bám.

Lắng đọng aerosol trong ngọn lửa là một quá trình sản xuất nano nhanh chóng kết hợp sản xuất hạt và lắp ráp màng chức năng trong một bước duy nhất và mang lại tính linh hoạt cao trong thành phần vật liệu cũng như trong các đặc tính của các hạt nano. Hoạt tính chống SARS-CoV-2 của màng hạt nano sau đó được kiểm tra khi ủ virus lên đến 2 giờ ở 37 °C và được định lượng bằng xét nghiệm mảng bám.

Các hạt nano được chế tạo bằng vật liệu hỗ trợ (SiO 2 có cấu trúc nano) để ức chế sự kết hợp hoàn toàn của chúng trong quá trình tổng hợp ngọn lửa do nhiệt độ cao trong lò phản ứng và điểm nóng chảy thấp của Ag. Các màng hạt nano trên cả đế phẳng thủy tinh rắn và vật liệu lọc xốp được chế tạo với thời gian lắng đọng là 15 s, càng làm nổi bật bản chất nhanh chóng của quá trình này. 

Hình 2 cho thấy ảnh hiển vi điện tử truyền qua (TEM) của (a) Ag / SiO 2, (b) Các hạt nano CuO và (c) ZnO đã được thu hồi từ phương tiện lọc xốp. Cả ba mẫu đều thể hiện đặc điểm cấu trúc kết tụ dạng fractal của vật liệu tạo ra từ ngọn lửa. Sự phân bố kích thước hạt cơ bản từ những hình ảnh TEM này cho cả ba mẫu, cùng với đường kính hạt trung bình của chúng, được thể hiện trong Hình 2d-f đối với Ag, CuO và ZnO, tương ứng. Đường kính hạt nano cơ bản trung bình (d TEM ) là ~ 5 nm, trong khi kích thước (d TEM) từ CuO và ZnO là ~ 10 nm. Hình 2g cho thấy các dạng nhiễu xạ tia X của các hạt nano đã được chuẩn bị sẵn như được thu thập trên bộ lọc sợi thủy tinh, cùng với kích thước tinh thể trung bình d XRD của chúng, phù hợp tốt với d TEM giá trị thu được bằng kính hiển vi điện tử. Các vị trí pic tương ứng đối với các thành phần pha tinh thể Ag, CuO và ZnO cũng được hiển thị, khẳng định độ tinh khiết của các mẫu.

Hình 2. Hình ảnh TEM của các hạt nano được cạo ra từ lớp phủ nano được ủ trên đế thủy tinh cho các mẫu ( a ) Ag / SiO 2 , ( b ) CuO và ( c ) ZnO. (d - f) Sự phân bố kích thước hạt thu được từ ảnh TEM cho cả ba mẫu. ( g ) Các dạng nhiễu xạ tia X của lớp phủ nano trên đế thủy tinh cùng với kích thước tinh thể trung bình của chúng.

Hình 3 cho thấy hình ảnh kính hiển vi điện tử quét từ trên xuống của các màng hạt trên (a) đế thủy tinh rắn và (b) phương tiện lọc xốp. Các lớp phim hạt tương đối đồng nhất trên nền thủy tinh phẳng và thể hiện cấu trúc dạng nano phù hợp với màng hạt nano được tạo ra bởi quá trình aerosol. Tương tự như vậy, các hạt nano dường như bao phủ đồng nhất các sợi của vật liệu lọc như trong Hình 3 b. Hình 3 c – e cũng cho thấy phổ tia X phân tán điện tử của các màng hạt khi lắng đọng trên các bộ lọc sợi thủy tinh xốp cho thấy thành phần nguyên tố của chúng, khẳng định thêm sự hiện diện của các hạt nano Ag, CuO và ZnO ở đó (Si, Na, Al, K tín hiệu bắt nguồn từ nền lọc sợi thủy tinh).

Hình 3. Kính hiển vi điện tử quét ảnh của cả ba lớp phủ nano Ag, CuO và ZnO trên ( a ) đế thủy tinh phẳng và ( b ) vật liệu lọc xốp cùng với phổ tia X phân tán năng lượng của chúng trong ( c - e ), tương ứng.

Quá trình thời gian của khả năng kháng virus của các lớp phủ đã phát triển được kiểm tra thêm bằng xét nghiệm mảng bám. Một giọt chứa virus được đưa vào màng hạt nano, và một chất nền thủy tinh trơn khác có cùng kích thước được đặt lên trên để làm phẳng giọt và tránh bay hơi. Mô hình hoạt động kháng virus ở đây được thiết kế đặc biệt để so sánh khả năng kháng virus của từng vật liệu nano. Sau khi ủ ở nhiệt độ phòng lần lượt là 5, 30 và 120 phút, phiến kính trên cùng được nâng lên và các mặt tiếp xúc với virus của hai đế thủy tinh được rửa bằng PBS. Nước rửa trải qua tám lần pha loãng 2 lần liên tiếp với môi trường nhiễm khuẩn để xác định hiệu quả. 

Hinh 4 hiển thị (a) tải lượng virus  (số mảng) sau 5, 30 và 120 phút đối với cả ba màng hạt nano khác nhau trên đế thủy tinh cùng với mẫu đối chứng (chất nền thủy tinh tinh khiết) và (b) vi rút giảm% CuO và Ag / SiO 2bề mặt phủ hạt nano so với độ ổn định của virus trên thủy tinh. Trên thủy tinh tinh khiết, tải lượng virus dường như giảm khá nhanh trong 30 phút đầu tiên, nhưng sau đó vẫn ổn định trong 2 giờ. Màng hạt nano ZnO dường như không ảnh hưởng đáng kể đến sự ổn định của vi rút theo thời gian. Tuy nhiên, màng hạt nano CuO dường như làm giảm đáng kể tải lượng vi rút sau 30 phút (giảm 54%), và sau 120 phút, nó giảm tới 76%. Sự giảm tải lượng virus  này trên bề mặt CuO phù hợp với các quan sát về thời gian bán hủy khoảng 1 giờ của SARS-CoV-2 trên bề mặt đồng. Lớp phủ oxit cupric dạng hạt có kích thước micron trên vật liệu nền thép hoặc thủy tinh cũng có khả năng làm giảm đáng kể khả năng lây nhiễm SARS-CoV-2, mặc dù việc xử lý ở nhiệt độ cao trong quá trình chế tạo chúng có thể gây ra những hạn chế đối với việc sử dụng chúng như lớp phủ trên phương tiện lọc xốp. Ngược lại, quá trình phủ lắng đọng sol khí được sử dụng ở đây cho phép chế tạo lớp phủ trên nhiều bề mặt khác nhau, bao gồm cả các bộ lọc xốp, như thể hiện trong Hình 3 b. 

Quan trọng nhất, Ag / SiO 2màng hạt nano thể hiện tác dụng mạnh mẽ nhất đối với tải lượng vi rút còn sót lại sau 5 phút với mức giảm đáng kể 75% và giảm tới 98% sau 120 phút, làm nổi bật tiềm năng của màng nano như một lớp phủ kháng vi rút hiệu quả. Sau 120 phút, không có giá trị có ý nghĩa thống kê nào thu được, và điều này được cho là do sự thay đổi của các phép đo ở các điều kiện này. Tuy nhiên, trong trường hợp của máy cắt nano, sự giảm có hai bậc về độ lớn và các thanh sai số không chồng lên nhau cho thấy rằng mức giảm được quan sát ở đây trên thực tế là lớn và không phải là một đồ tạo tác thí nghiệm. Điều này cũng được chứng minh bởi thực tế là sự khác biệt về số lượng mảng bám ở cả hai thời điểm trước đó thực sự thấp hơn đáng kể, mặc dù mức giảm thực tế ít rộng rãi hơn.

Hình 4. ( a ) Tải lượng virus tồn dư SARS-CoV-2 được xác định bằng xét nghiệm mảng bám trên lớp phủ nano đã phát triển lên đến 120 phút ( n = 3), * p <0,05, tất cả các giá trị p trong Bảng S1  ( b ) Mức giảm% của SARS-CoV-2 trên bề mặt phủ hạt nano CuO và Ag / SiO 2 được tính từ ( a ); thanh lỗi là sai số chuẩn của giá trị trung bình.

4. Kết luận

Trong số ba vật liệu nano được nghiên cứu ở đây, nanosilver thể hiện hoạt tính kháng virus cao nhất đối với SARS-CoV-2, giảm tải lượng virus lên đến 75% sau 5 phút và 98% sau 120 phút. Những kết quả này cung cấp bằng chứng về nguyên tắc và khuyến khích sự phát triển hơn nữa của công nghệ này để tìm ra các vật liệu ức chế mạnh hơn. Nanosilver là một vật liệu nano kháng khuẩn nổi tiếng và cũng được báo cáo là có khả năng ức chế một số loại vi rút, bao gồm virus herpes simplex 2, virus  viêm gan B, virus Tacaribe,virus vaccin và virus cúm A H1N1. Hoạt động chống vi khuẩn của nanosilver phần lớn được cho là do Ag + được giải phóng các ion khi nó tiếp xúc với môi trường nước, với tới 40% ion Ag + được giải phóng cho kích thước được sử dụng ở đây, và nó đã được chứng minh thêm rằng nó nhắm vào vỏ tế bào vi khuẩn bằng cách tạo ra các loại oxy phản ứng. SARS-CoV-2 là một loại vi rút được bao bọc, và do đó hoạt động kháng virus có thể được quy cho cùng một cơ chế, mặc dù người ta cũng đã chứng minh rằng các ion Ag + ức chế virus bằng cách liên kết với các protein của virus hoặc trực tiếp phân giải màn. 

Hoạt tính kháng khuẩn của đồng oxit cũng được cho là do tạo ra các loại oxy phản ứng, nhưng hoạt tính xúc tác liên quan đến bề mặt cũng có thể góp phần. Trong quá trình ủ lớp phủ nano với giọt chứa virus, các hạt vi rút có thể bị bất hoạt do tương tác trực tiếp với bề mặt và do tương tác của chúng với các ion được giải phóng (Ag + , Cu 2+ và Zn 2+). Khi xem xét sự vận chuyển của các phần tử virus trong dung dịch lỏng và sự vận chuyển của các ion được giải phóng dựa trên hệ số khuếch tán của chúng (phương trình Stokes-Einstein), sự vận chuyển của các hạt virus  chậm hơn nhiều so với các ion, cho thấy rằng bất kỳ hiệu ứng kháng virus nào từ ion sẽ xảy ra nhanh hơn. Kết quả của nghiên cứu này cung cấp hướng dẫn cần thiết cho lĩnh vực chăm sóc sức khỏe để sử dụng các lớp phủ chống vi rút trên bề mặt rắn chống lại sự lây truyền của fomite dẫn đến các sự kiện siêu lan truyền cũng như để giảm thiểu sự lây truyền qua sol khí bằng cách sử dụng các bộ lọc khí dựa trên nano cho COVID-19 và bất kỳ đại dịch nào trong tương lai do các mầm bệnh tương tự gây ra.