Tác dụng kháng virus mạnh mẽ của các hạt nano bạc đối với SARS-CoV-2
Feb 24, 2022
Đại dịch COVID-19 đang lan rộng mà không được kiểm soát do thiếu các biện pháp chống vi rút hiệu quả. Các hạt nano bạc (AgNP) đã được nghiên cứu để có đặc tính kháng vi-rút và được cho là có khả năng ức chế SARS-CoV-2. Do nhu cầu về tác nhân hiệu quả chống lại SARS-CoV-2, Một nghiên cứu đã đánh giá tác dụng kháng vi rút của AgNPs. Họ đã đánh giá rất nhiều AgNP với các kích thước và nồng độ khác nhau và quan sát thấy rằng các hạt có đường kính khoảng 10 nm có hiệu quả trong việc ức chế SARS-CoV-2 ngoại bào ở nồng độ từ 1 đến 10 ppm trong khi tác dụng gây độc tế bào được quan sát thấy ở nồng độ 20 ppm trở lên. Thử nghiệm xâm nhập pseudovirus dựa trên Luciferase cho thấy AgNPs ức chế mạnh mẽ bước xâm nhập của virus thông qua việc phá vỡ tính toàn vẹn của virus.
1. Giới thiệu
Kim loại nguyên tố, Bạc (Ag) có tác dụng kháng khuẩn phổ rộng chống lại các vi khuẩn, nấm và vi rút khác nhau. Do tính linh hoạt của chúng, các hạt nano Ag (AgNP) hiện đã được tìm thấy như một chất diệt vi khuẩn cho các bề mặt sinh học ở nhiều dạng khác nhau như băng vết thương, thiết bị y tế, thuốc xịt khử mùi và vải. Một số nghiên cứu đã chứng minh tác dụng kháng vi rút mạnh mẽ của AgNP đối với các vi-rút gây bệnh cho người khác nhau như vi-rút hợp bào đường hô hấp (RSV), vi-rút cúm, vi-rút Norovirus, vi-rút viêm gan B (HBV) và vi-rút suy giảm miễn dịch ở người (HIV). Ngoài những vi rút này, vì Ag đã được chứng minh là có thể tiêu diệt SARS-CoV, họ đã đưa ra giả thuyết về khả năng mạnh mẽ của AgNP trong việc ức chế SARS-CoV-2. Cho đến nay, không có nghiên cứu nào chứng minh trực tiếp ảnh hưởng của AgNPs đối với SARS-CoV-2. Họ đã thử nghiệm các hạt nano bạc dạng keo (cAg), các hạt nano Ag nguyên tố đơn giản có đường kính khác nhau (AgNP n ) và polyvinylpyrolidone có giới hạn các hạt nano bạc 10 nm (PVP – AgNP 10 ) chống lại SARS-CoV-2 để tìm ra kích thước và nồng độ Ag hiệu quả nhất có thể ức chế SARS-CoV-2. Họ đề xuất rằng AgNPs có thể được sử dụng trên các bề mặt vô tri và phi sinh học để kiểm soát hiệu quả đại dịch COVID-19 đang diễn ra đồng thời thực hiện cẩn thận không để lạm dụng nó.
2. Vật liệu và phương pháp
2.1. Nuôi cấy tế bào và nhân giống vi rút
VeroE6 / TMPRSS2 (Tế bào VeroE6 biểu hiện ổn định protease huyết thanh xuyên màng TMPRSS2, JCRB) và dòng tế bào Calu-3 được nuôi cấy trong DMEM chứa 10% FBS. SARS-CoV-2 (JPN / TY / WK-521) được lấy từ NIID, JAPAN, được lưu trữ trong các mẫu đặc biệt ở -80 ° C và được xử lý ở mức độ an toàn sinh học 3 (BSL3). Trong khi thực hiện các nghiên cứu về nhiễm trùng SARS-CoV-2, DMEM chứa 2% FBS đã được sử dụng.
2.2. Xét nghiệm mảng bám
Xét nghiệm mảng bám được thực hiện SARS-CoV-2 trên các dòng tế bào VeroE6 / TMPRSS2 và Calu-3 như được mô tả ở những nơi khác với những sửa đổi nhỏ. Các đĩa 96 giếng đã được gieo hạt với 5 × 10 4 tế bào mỗi giếng trong 10% FBS / DMEM và để phát triển qua đêm. Dung dịch virut được pha loãng trong các dung dịch pha loãng nối tiếp 10 lần trong FBS / DMEM 2%. Phần nổi phía trên giếng được loại bỏ và thay thế bằng dung dịch pha loãng virus trong các giếng được đánh dấu tương ứng và ủ ở 37 ° C trong 96 giờ, sau đó các tế bào được cố định bằng 4% formalin và nhuộm bằng màu tím pha lê 0,25% để hình dung các mảng trên nền trắng. Liều lây nhiễm nuôi cấy mô trung bình (TCID50) và tính đa dạng của nhiễm trùng (MOI) được tính toán từ các thử nghiệm bốn lần.
2.3. Công thức bạc
PVP-AgNP 10 ở nồng độ gốc 20 ppm (Cat No: 795925) và cAg (Cat No: 85131) được thu được từ Sigma. AgNP có kích thước khác nhau; AgNP 2 (Cat No: US7150), AgNP 15 (Cat No: US7091), AgNP 50 , AgNP 80 and AgNP 100 (US1038W) đã được mua từ US Research Nanomaterials, Inc. nồng độ được chuẩn bị bằng cách pha loãng trong nước cất vô trùng.
2.4. Thử nghiệm khả năng sống của tế bào
Xét nghiệm khả năng sống của tế bào CellTiter-Glo (Promega) là một xét nghiệm dựa trên sự phát quang giúp phát hiện một cách định lượng các tế bào sống dựa trên mức adenosine triphosphate (ATP). Sự chết tế bào do nhiễm độc tế bào qua trung gian Ag hoặc nhiễm virus có thể được định lượng nhanh chóng bằng cách sử dụng Cell-Titer Glo. 50 μl Chất nền CellTiter-Glo (Promega) đã được thêm vào các tế bào và khả năng tồn tại của chúng được đo dựa trên cường độ phát quang do Hệ thống GloMax Discover (Promega) phát hiện 10 phút sau đó.
2.5. RT-qPCR
RNA của virus được chiết xuất từ dịch nuôi cấy bằng cách sử dụng QIAamp virus RNA Mini Kit (Qiagen) và được bảo quản ở -80 ° C cho đến khi phân tích thêm. RNA virus chiết xuất được định lượng bằng Hệ thống thời gian thực CFX96 (Bio-rad) với TaqMan Fast virus 1-Step Master Mix (Thermo) sử dụng 5′-AAATTTTGGGGACCAGGAAC-3 ′ và 5′-TGGCAGCTGTGTAGGTCAA-3 ′ làm bộ mồi và 5′-FAM-ATGTCGCGCATTGGCATGGA-BHQ-3 ′ làm đầu dò.
2.6. Nghiên cứu độc tính tế bào
cAg hoặc AgNPs ở nồng độ mong muốn được thêm vào dòng tế bào VeroE6 / TMPRSS2 hoặc Calu-3 được nuôi cấy trong đĩa trắng 96 giếng và được ủ ở 37 ° C trong 48 hoặc 96 giờ tương ứng, sau đó các tế bào được rửa bằng PBS và khả năng sống sót là định lượng bằng xét nghiệm CellTiter-Glo.
3. Nghiên cứu tương tác Silver và SARS-CoV-2
3.1. Xét nghiệm tiền xử lý vi rút
Virus ở MOI là 0,05 (đối với VeroE6 / TMPRSS2) hoặc 0,5 (đối với Calu-3) trong DMEM chứa 2% FBS được ủ với dung dịch AgNP 2 ppm trong 1 giờ ở 37 ° C. Hỗn hợp virus-AgNP tương ứng được thêm vào tế bào VeroE6 / TMPRSS2 hoặc Calu-3 trong 96 đĩa giếng và ủ trong 48 giờ hoặc 96 giờ tương ứng ở 37 ° C. Khả năng sống sót của tế bào được định lượng bằng xét nghiệm CellTiter-Glo và các bản sao của virus trong dịch nổi được định lượng bằng RT-qPCR.
3.2. Xét nghiệm tế bào sau xử lý
Tế bào VeroE6 / TMPRSS2 bị nhiễm SARS-CoV-2 (MOI = 0,05) và được ủ trong 2 giờ ở 37 ° C. Các giếng được rửa bằng PBS để loại bỏ vi rút ngoại bào và phủ DMEM có chứa 2% FBS với 2 ppm PVP-AgNP 10 và ủ trong 48 giờ ở 37 ° C. Khả năng sống sót của tế bào được định lượng bằng xét nghiệm CellTiter-Glo và các bản sao của virus trong dịch nổi được định lượng bằng RT-qPCR.
3.3. Xét nghiệm tiền xử lý tế bào
Tế bào VeroE6 / TMPRSS2 được xử lý bằng 2 ppm PVP-AgNP 10 và ủ trong 3 giờ ở 37 ° C. Sau đó, các giếng được rửa bằng PBS để loại bỏ AgNPs tự do trong môi trường và phủ DMEM có chứa 2% FBS với SARS-CoV-2 (MOI = 0,05) và ủ trong 48 giờ ở 37 ° C. Khả năng sống sót của tế bào được định lượng bằng xét nghiệm CellTiter-Glo và các bản sao của virus trong dịch nổi được định lượng bằng RT-qPCR.
3.4. Miễn dịch huỳnh quang
Các tế bào được cố định bằng 4% paraformaldehyde và được làm thấm bằng 0,5% Triton X-100, và sau đó được chặn bằng Blocking One (Nacalai) ở nhiệt độ phòng trong 15 phút. Các tế bào được ủ với kháng thể đa dòng chống lại kháng thể Protein Nucleocapsid SARS-CoV-2 (độ pha loãng 1: 100, Novus NB100-56576) ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ. Sau khi ủ, tế bào được nhuộm bằng kháng thể chống thỏ đánh dấu Alexa 568 (pha loãng 1: 1000, Thermo) trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Hạt nhân được nhuộm bằng ProLong Gold Antifade Mountant với DAPI (Thermo). Hình ảnh được chụp bởi kính hiển vi huỳnh quang BZ-9000 (Keyence).
3.5. Thử nghiệm xâm nhập Pseudovirus
Pseudotype lentivirus được tạo ra do sự lây nhiễm nhất thời của tế bào HEK293 với pNL4-3. Luc.RE− và pSARS2-Spike-FLAG với tỷ lệ 1: 1. Dịch nuôi cấy có chứa pseudovirus được thu thập 48 giờ sau khi truyền và lọc qua bộ lọc Millex-HV 0,45 μm (Merck). Đối với thử nghiệm đầu vào, tế bào VeroE6 / TMPRSS2 được gieo trong đĩa 96 giếng được rửa sạch và cấy 100 μl môi trường chứa pseudovirus có hoặc không có PVP-AgNP 10 . Kháng thể trung hòa được sử dụng như một biện pháp kiểm soát sự ức chế xâm nhập. 48 giờ sau khi cấy, tế bào được rửa sạch và bổ sung 40 μl Chất nền bóng sáng (Promega). Hoạt động của Luciferase được đo bằng Hệ thống Khám phá GloMax (Promega).
4. Kết quả
4.1. Độc tính tế bào, liều lượng hiệu quả và thời gian tiếp xúc
AgNP thể hiện độc tính tế bào đối với tế bào động vật có vú bằng cách tạo ra các loại oxy phản ứng (ROS) [ 8 ]. Chúng tôi muốn đánh giá độc tính tế bào phụ thuộc nồng độ do Ag biểu hiện trên các dòng tế bào VeroE6 / TMPRSS2 (không phải người) và Calu-3 (tế bào biểu mô phổi của người). cAg được pha loãng theo dõi và thêm vào các tế bào trong 96 đĩa giếng và khả năng sống của tế bào được đánh giá sau 48 giờ sử dụng xét nghiệm CellTiter-Glo. Ag được phát hiện thể hiện độc tính tế bào ở nồng độ từ 20 phần triệu (ppm) trở đi trong cả VeroE6 / TMPRSS2 (Hình 1 A) và dòng tế bào Calu-3 (Hình 1B).
Vì cAg chứa các kích thước hạt thay đổi từ 1 đến 1000 nm, chúng tôi đã sử dụng nó như một màn hình ban đầu để xác định ảnh hưởng của AgNPs lên SARS-CoV-2. Tính đa nhiễm (MOI) của SARS-CoV-2 được tính toán bằng các thí nghiệm độc lập và được tìm thấy lần lượt là 0,05 và 0,5 đối với VeroE6 / TMPRSS2 và Calu-3. Huyền phù vi rút ở MOI cố định được xử lý với mỗi độ pha loãng cAg nối tiếp trong 1 giờ và sau đó được cấy vào các tế bào VeroE6 / TMPRSS2 và Calu-3.Hình 2 MỘT). Trong các tế bào Calu-3, tải lượng vi rút giảm đáng kể được quan sát thấy ở khoảng nồng độ cAg tương tự (Hình 2B). Trong khi các ion kim loại được biết đến là chất ức chế PCR ở nồng độ cao, chúng tôi khẳng định rằng ở nồng độ hiệu quả (2 ppm), Ag không ức chế sự khuếch đại và thích hợp để phân tích RNA virus trong các mẫu chứa Ag ( Hình S1 ) [ 9 ]. Vì 2 ppm cũng thấp hơn 10 lần so với nồng độ chất độc tế bào, nên nó được chọn làm nồng độ mong muốn để thử nghiệm thêm.
Các nghiên cứu trước đây đã ghi nhận hiệu lực phụ thuộc vào kích thước của AgNPs trong việc bất hoạt vi rút, với kích thước hạt ≤10 nm được báo cáo là có tác dụng kháng vi rút tối đa [ 10]. Vì cAg chứa các hạt Ag có kích thước khác nhau, chúng tôi dự đoán rằng các hạt có kích thước khoảng 10 nm trong cAg sẽ phát huy tác dụng kháng vi-rút. Để chứng minh điều này, chúng tôi sử dụng xét nghiệm tiền xử lý vi rút (VPrA) để kiểm tra tác dụng kháng vi rút của các AgNP có kích thước khác nhau từ 2 đến 100 nm đối với vi rút ngoại bào. Virus được xử lý bằng dung dịch AgNPs 2 ppm với các kích thước khác nhau trong 1 giờ và hỗn hợp virus-AgNP được thêm vào các tế bào VeroE6 / TMPRSS2 và Calu-3. Khả năng sống sót của tế bào được định lượng bằng xét nghiệm CellTiter-Glo trong VeroE6 / TMPRSS2 và các bản sao virus trong dịch nổi được định lượng bằng RT-qPCR trong tế bào Calu-3. Tác dụng kháng vi rút được ghi nhận với các AgNP có kích thước từ 2 đến 15 nm (Hình 2C và D). AgNP 2 cho thấy độc tính tế bào ở 2 ppm trong khi các kích thước khác thì không ( Hình S2 ). Do đó, chúng tôi chọn PVP-AgNP 10 để thử nghiệm thêm. Vì chúng tôi đã quan sát thấy hoạt tính kháng vi-rút tuyệt vời trong VPrA lúc 1 giờ, nên chúng tôi muốn biết thời gian tiếp xúc tối thiểu cần thiết của Ag để ức chế vi-rút. Nghiên cứu khóa học thời gian được thực hiện dựa trên VPrA với PVP-AgNP 10 cho thấy sự ức chế đáng kể sau 30 phút tiếp xúc ( Hình S3 ).
4.2. Bạc ức chế vi rút ngoại bào bằng cách ngăn chặn sự xâm nhập của vi rút
Tiếp theo, chúng tôi thực hiện VPrA, xét nghiệm sau xử lý tế bào (CPoA) và xét nghiệm trước xử lý tế bào (CPrA) trên SARS-CoV-2 bằng cách sử dụng PVP-AgNP 10 trong VeroE6 / TMPRSS2 để quan sát tác động của Ag đối với virus ngoại bào và nội bào. (Hình 3 MỘT). VPrA cho thấy sự ức chế hiệu quả đối với các virion tự do ngoại bào, đặc trưng bởi cả việc giảm tế bào chết và cũng làm giảm tải lượng vi rút xuống mức không đáng kể (Hình 3B và C). Chúng tôi tiếp tục thực hiện CPoA để phát hiện khả năng ngăn chặn vi rút của Ag trong các tế bào đã bị nhiễm bệnh. Trong thiết kế thử nghiệm này, các tế bào VeroE6 / TMPRSS2 được cho phép bị nhiễm SARS-CoV-2 (MOI 0,05) trong 2 giờ sau đó các vi rút ngoại bào được rửa sạch và sau đó các tế bào bị nhiễm bệnh được xử lý bằng 2 ppm PVP-AgNP 10 . Chúng tôi đã quan sát thấy sự bảo vệ đáng kể của các tế bào bị nhiễm bệnh và ức chế tải lượng vi rút với PVP-AgNP 10 (Hình 3B và C). Ngoài ra, chúng tôi thực hiện CPrA để đánh giá khả năng của các tế bào được xử lý trước bằng bạc trong việc chống lại sự lây nhiễm vi rút. Tế bào VeroE6 / TMPRSS2 được ủ với 2 ppm PVP-AgNP 10 trong 3 giờ, sau đó các tế bào được rửa để loại bỏ bạc không liên kết, sau đó là nhiễm SARS-CoV-2 (MOI 0,05). Vào cuối 48 giờ, vi rút được tìm thấy chỉ bị ức chế một phần (Hình 3C).
Chúng tôi xác nhận tác dụng kháng vi rút phụ thuộc vào kích thước của PVP-AgNP 10 bằng cách sử dụng phân tích miễn dịch huỳnh quang được thực hiện trên mô hình thử nghiệm VPrA; Nhiễm SARS-CoV-2 đã được ngăn chặn một cách hiệu quả bởi AgNP 10 chứ không phải AgNP 100 (Hình 4 MỘT). Thử nghiệm mảng bám cho thấy bạc đạt được sự ức chế hoàn toàn 0,05 MOI, cao hơn một log 10 lần so với kiểm soát vi rút. Sự ức chế một phần được quan sát thấy với tải lượng vi rút cao hơn bắt đầu từ 0,5 MOI (Hình 4B). Để đánh giá vai trò của AgNP trong sự xâm nhập của virus, chúng tôi đã thực hiện xét nghiệm xâm nhập pseudovirus dựa trên luciferase. PVP-AgNP 10 ức chế mạnh sự xâm nhập của vi-rút giả được đặc trưng bởi sự giảm đáng kể hoạt động của luciferase tương tự như hoạt động của kháng thể trung hòa được sử dụng làm đối chứng (Hình 4C).
